Pneumocystis en perros: protozoo parece, levadura ya casi es.

F. Javier Cabañes.

Grupo de Micología Veterinaria, Departamento de Sanidad y Anatomía Animales, Facultad de Veterinaria, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España.

Pronto hará 25 años que un Yorkshire terrier macho de 14 meses ingresó en el Hospital Clínico Veterinario de la Universidad Autónoma de Barcelona, con un historial de tos no productiva crónica y disnea aguda. El perro falleció cinco horas después de su admisión. Fue nuestro primer caso de neumonía por Pneumocystis (PCP) [Cabañes et al., 2000]. Aunque muchas cosas han cambiado desde entonces, la PCP sigue siendo una enfermedad rara en perros y su diagnóstico en las clínicas veterinarias no es fácil. Por otra parte, debido a su baja incidencia, raramente es considerada en el diagnóstico diferencial en aquellos animales que presentan signos respiratorios crónicos.

Los microorganismos pertenecientes al género Pneumocystis son hongos unicelulares no cultivables, ampliamente distribuidos por todo el mundo [Ma et al., 2018]. Los miembros de este género presentan una especificidad aparentemente estricta con respecto a las especies animales que los hospedan, probablemente debido a una larga historia de coevolución o de adaptación a ellas. Aunque estos organismos se clasificaron originalmente como protozoos, actualmente, en base a distintos análisis genómicos y filogenéticos, se han incluido en el reino de los hongos. No obstante, su pared celular carece de quitina y su membrana celular contiene colesterol en vez de ergosterol, características que los hacen únicos en este reino. Recientemente, se ha podido constatar que forman un grupo monofilético en la subdivisión Taphrinomycotina de los ascomicetos, cercano a las levaduras del género Schizosaccharomyces.

Quistes (formas redondeadas oscuras) y trofozoítos (formas claras verdosas) de Pneumocystis carinii f. sp. canis llenando los espacios alveolares de un perro con neumocistosis. Tinción de Grocott. F. Javier Cabañes©

Si bien estos microorganismos infectan una amplia gama de especies de mamíferos, hasta el momento sólo se han propuesto formalmente cinco especies: P. jirovecii en humanos, P. murina en ratones, P. oryctolagi en conejos y P. carinii y P. wakefieldiae en ratas. Los Pneumocystis detectados en otros mamíferos suelen denominarse utilizando el taxón infraespecífico «forma specialis» (p.e. Pneumocystis carinii f. sp. canis en el caso de los perros). El ciclo de vida de estos microorganismos sigue siendo poco conocido, principalmente debido a la imposibilidad de cultivarlos in vitro.

Como parásitos extracelulares, estos organismos se han encontrado casi exclusivamente en el espacio alveolar de los pulmones de los mamíferos. Debido a la nueva posición taxonómica que presentan, se ha planteado la hipótesis de que el ciclo de vida de Pneumocystis incluye una fase asexual y una sexual, con dos formas morfológicas primarias: la forma trófica o trofozoíto y el quiste o asca, que es la forma infecciosa responsable de la transmisión.

En una reciente revisión que incluye la mayoría de casos publicados de PCP en perros [Weissenbacher-Lang et al., 2018], los autores señalan que esta enfermedad se diagnostica con mayor frecuencia en animales jóvenes y más frecuentemente en ciertas razas, como el Cavalier King Charles spaniel y el perro salchicha miniatura, que presentan predisposición a tener cierto grado de inmunodeficiencia. En este estudio, la taquipnea, la disnea y la tos fueron los signos respiratorios más frecuentes.

En medicina humana, el lavado broncoalveolar se considera el procedimiento de diagnóstico de referencia para la neumocistosis. Por desgracia, esta técnica no parece útil para detectar con cierta fiabilidad las diferentes formas de Pneumocystis en perros. Por el contrario, los aspirados y los frotis pulmonares son positivos en casi todos los casos. Para este último tipo de muestras y para las muestras de tejido incluidas en parafina, la tinción de Grocott es la más sensible y fácil de evaluar, en comparación con otras tinciones, debido a un mayor contraste de color de las paredes negras de los quistes contra el fondo principalmente verde.

Aunque se han descrito otras técnicas para la detección de estos patógenos (p.e. inmunohistoquímica, hibridación in situ), parece ser que la de la PCR presenta ciertas ventajas y podría evitar intervenciones quirúrgicas invasivas. Debido a su alta sensibilidad, esta técnica podría ser útil en muestras de lavados broncoalveolares. Como ya hemos comentado, estas muestras suelen presentar un bajo número de estructuras de Pneumocystis, difícilmente detectables mediante citología.
En los perros con PCP, el tratamiento inmediato es esencial para su posible recuperación. El uso de trimetoprim-sulfonamida combinado con dosis bajas de corticosteroides antiinflamatorios aumenta sustancialmente las posibilidades de supervivencia de los perros afectados. Los macrófagos alveolares generan varios mediadores que potencian la respuesta inflamatoria frente a Pneumocystis y su liberación masiva puede aumentar la lesión pulmonar y el deterioro respiratorio. Un diagnóstico erróneo o tardío puede conducir a la progresión de la enfermedad con una grave disfunción respiratoria o, en la mayoría de las ocasiones, a la muerte del animal.

Diagnóstico de las dermatitis y otitis por Malassezia en perros y gatos, ¿es sólo cuestión de contar?

F. Javier Cabañes.

Grupo de Micología Veterinaria, Departamento de Sanidad y Anatomía Animales, Facultad de Veterinaria, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España.

Febrero 2020.

Tal como señalan las últimas recomendaciones de consenso publicadas en el ámbito de la Asociación Mundial de Dermatología Veterinaria [Bond et al., 2020], actualmente las dermatitis causadas por Malassezia se consideran trastornos comunes en la especie canina y ocasionales en la felina. En la clínica de pequeños animales, esta enfermedad ha evolucionado en pocos años de presentar un diagnóstico controvertido a uno rutinario, con beneficios muy claros para el bienestar de muchas mascotas. Aunque existen diferentes formas clínicas, tanto en el gato como en el perro los signos más frecuentes son eritema, lesiones descamativas con exudado céreo, localizadas frecuentemente en zonas con pliegues cutáneos y prurito.

Como Malassezia pachydermatis forma parte de la microbiota normal de la piel de estos animales, la cuantificación de las células de esta levadura presentes en las lesiones es clave para el diagnóstico de este trastorno. Se han propuesto varios métodos citológicos y de cultivo para su enumeración en la piel. Como se menciona en estas directrices, en la consulta veterinaria se utilizan diferentes técnicas citológicas para evaluar las poblaciones de M. pachydermatis. Actualmente, la toma de muestras mediante cinta adhesiva presenta una amplia aceptación ya que permite de una forma sencilla la recuperación de células de la capa más externa de la piel y sus microorganismos asociados. Posteriormente, se tiñen mediante una tinción rápida de Diff-Quik y se observan al microscopio. Sin embargo, como se indica en estas recomendaciones, los recuentos elevados no tienen por qué ser necesariamente relevantes desde el punto de vista clínico en todos los casos. Por el contrario, las poblaciones normales o al menos más bajas pueden ser suficientes para exacerbar la inflamación cutánea en pacientes con respuestas de hipersensibilidad inmediata o retardada.

Citología obtenida mediante cinta adhesiva de la piel de un perro con dermatitis causada por Malassezia pachydermatis, en la que se observan numerosas células de esta levadura. Tinción de Diff-Quik. F. Javier Cabañes©
Citología obtenida mediante cinta adhesiva de la piel de un perro con dermatitis causada por Malassezia pachydermatis, en la que se observan numerosas células de esta levadura. Tinción de Diff-Quik. F. Javier Cabañes©

Por otro lado, la otitis externa asociada a M. pachydermatis es una enfermedad inflamatoria común del canal auditivo externo de los perros. A menudo se caracteriza por la presencia de un exudado céreo oscuro y húmedo, con presencia de eritema y prurito. El diagnóstico de la otitis externa causada por M. pachydermatis se basa en la observación de lesiones compatibles, la respuesta a la terapia antimicótica y la presencia de un número elevado de levaduras por observación microscópica directa. En este caso, la toma de muestra mediante hisopo es la técnica más frecuentemente utilizada para enumerar las células de levaduras presentes en el canal auditivo externo, bien sea mediante citología y/o cultivo.

Gráfico de amplificación (qPCR) de dos muestras obtenidas del canal auditivo externo de dos perros después de 30 ciclos. Un hisopo se obtuvo de un perro con otitis externa por Malassezia pachydermatis (curva superior); el otro se obtuvo de un perro sano (curva inferior). F. Javier Cabañes©
Gráfico de amplificación (qPCR) de dos muestras obtenidas del canal auditivo externo de dos perros después de 30 ciclos. Un hisopo se obtuvo de un perro con otitis externa por Malassezia pachydermatis (curva superior); el otro se obtuvo de un perro sano (curva inferior). F. Javier Cabañes©

El cultivo microbiológico no suele realizarse en el ámbito clínico. Sin embargo, aunque el examen citológico tiene una buena especificidad, presenta una baja sensibilidad en comparación con el cultivo. Por lo tanto, necesitamos disponer de otros métodos para detectar y cuantificar las levaduras de M. pachydermatis en muestras de perros con otitis externa, que sean específicos, sensibles, precisos y rápidos. En nuestro laboratorio hemos desarrollado recientemente una PCR cuantitativa (qPCR) para detectar y cuantificar levaduras de M. pachydermatis, validando la técnica con muestras recogidas mediante hisopo del conducto auditivo externo de perros [Puig et al., 2019]. Nuestra qPCR utiliza el gen de la β-tubulina como diana, que presenta la ventaja de ser un gen unicopia. Nuestro ensayo qPCR proporciona una cuantificación precisa de las levaduras de M. pachydermatis, es más sensible que la citología, y podría utilizarse para controlar la respuesta al tratamiento. Aunque el diagnóstico de las dermatitis y otitis por Malassezia no sea sólo cuestión de contar levaduras, este estudio aporta una forma diferente y más precisa de hacerlo.

Dermatofitosis en perros y gatos: nuevas recomendaciones. F. Javier Cabañes

F. Javier Cabañes.

Grupo de Micología Veterinaria, Departamento de Sanidad y Anatomía Animales, Facultad de Veterinaria, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España.

Enero 2020.

Los dermatofitos siguen citándose entre las causas más frecuentes de problemas dermatológicos en los animales domésticos. No obstante, sólo un pequeño porcentaje de estas especies causan normalmente tiñas en los animales [Cabañes, 2000]. Tal como ya hemos comentado en este blog, los nombres de algunas de las especies que causan dermatofitosis han cambiado y actualmente se engloban en los géneros Lophophyton, Nannizzia, Microsporum y Trichophyton. Hay que destacar que los animales funcionan como reservorio de los denominados dermatofitos zoófilos y sus infecciones presentan una considerable importancia zoonótica, ya que se transmiten con cierta frecuencia al hombre. Por ejemplo, el gato es el principal reservorio de Microsporum canis, siendo esta especie la mayor responsable de las tiñas de los perros y de los gatos. En el caso de los gatos, el porcentaje de aislamiento suele ser superior al 90%. En ambas especies animales la dermatofitosis es una enfermedad frecuente en individuos jóvenes.

Típica lesión alopécica circular en un cachorro con dermatofitosis. La infección del dermatofito avanza de forma radial, afecta las raíces de los pelos y ocasiona su caída. Estos hongos se alimentan principalmente de la queratina presente en los pelos y en la piel. F. Javier Cabañes©

Tal como se indica en las últimas recomendaciones de consenso sobre el diagnóstico y el tratamiento de la dermatofitosis en gatos y perros [Moriello et al. 2017], aportadas en el ámbito de la Asociación Mundial de Dermatología Veterinaria, M. canis se encuentran entre los principales microorganismos, junto con Campylobacter spp., Salmonella spp., Toxoplasma gondii, que con frecuencia se consideran de mayor preocupación a ser transmitidos por estos animales a sus dueños y personal de alto riesgo en la clínica veterinaria.

No obstante, tal como se puntualiza en estas directrices, la dermatofitosis, a pesar de ser una conocida zoonosis que causa lesiones en la piel de los humanos, es tratable y curable. Sin embargo, estos autores resaltan que hay pocos estudios en los que se haya investigado con precisión qué proporción de tiñas que se producen en el hombre es atribuible a las mascotas. Las enfermedades asociadas a las mascotas pueden ocurrir en cualquier individuo, pero tienen mayor riesgo los niños menores de 5 años, los adultos mayores de 65, las embarazadas y las personas con algún tipo de inmunodeficiencia.

Observación directa de una zona cercana a la raíz del pelo, en el que se observa un patrón de infección de tipo ectotrix, típico de las dermatofitosis animales. Se pueden apreciar numerosos artroconidios alrededor del pelo, que son los elementos fúngicos responsables de la transmisión de la enfermedad. Tinción de azul de lactofenol. F. Javier Cabañes©

Esta enfermedad se transmite principalmente por contacto con el pelaje o las lesiones de la piel de un animal infectado. Las escamas y el pelo procedentes de estos animales se pueden acumular en el ambiente y son también posibles fuentes de infección. Esto se debe principalmente al gran número de artroconidios que se forman en el pelo de los animales con dermatofitosis, que presentan generalmente diámetros inferiores a los 5 micrómetros y que son los causantes de la infección. No obstante, es difícil determinar la verdadera prevalencia de esta enfermedad, ya que no es de declaración obligatoria. Si bien en estas recomendaciones ninguna de las pruebas diagnósticas utilizadas habitualmente fue escogida como la de elección, se destaca que lo importante es saber que técnicas nos permiten confirmar la presencia o ausencia de una infección activa en el animal. En el laboratorio, el diagnóstico se realiza de forma tradicional por medio de la observación directa de los pelos con sospecha de dermatofitosis, prueba de total especificidad pero que presenta una moderada sensibilidad. Se confirma mediante el cultivo de los pelos en medios apropiados, prueba que presenta mayor sensibilidad y permite además la identificación de la especie implicada. El cultivo también permite detectar la presencia de portadores mecánicos transitorios y los infectados sin lesiones aparentes, y monitorizar infecciones. Las técnicas de PCR pueden ser de utilidad, aunque hay que recordar que pueden dar resultados falsos positivos en casos de infecciones no activas, al detectar DNA de elementos fúngicos no viables. Con respecto al éxito del tratamiento en perros y gatos, en estas directrices se recomienda el uso simultáneo de antifúngicos sistémicos orales, como el itraconazol o la terbinafina, y la desinfección tópica del pelo de estos animales.

Micosis de las bolsas guturales: simpatía por Aspergillus nidulans. F. Javier Cabañes

Octubre 2019.

Grupo de Micología Veterinaria, Departamento de Sanidad y Anatomía Animales, Facultad de Veterinaria, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, España.

Los caballos presentan unas estructuras anatómicas que contienen aire, situadas en el lado dorsal de la cavidad faríngea denominadas bolsas guturales. Las paredes de estas bolsas están en contacto con nervios y vasos importantes que riegan el cerebro. Por este motivo, el desarrollo de ciertas especies fúngicas en las mucosas de estas bolsas puede ser la causa de una micosis especialmente grave. El crecimiento del hongo erosiona las arterias carótidas, produciéndose hemorragias importantes que causan la muerte fulminante del animal.

 Micelio de color blanquecino de una placa micótica detectada en una bolsa gutural de un caballo. F. Javier Cabañes© Mycology Micología AEM
Micelio de color blanquecino de una placa micótica detectada en una bolsa gutural de un caballo. F. Javier Cabañes©

Uno de los signos iniciales más frecuentes en estos casos es la presencia de hemorragia nasal. También se suele detectar disfagia, debido a la afectación de diversos nervios anejos que controlan la deglución, y determinadas afecciones neurológicas. El tratamiento de elección suele ser quirúrgico, mientras que la terapia con antifúngicos presenta una eficacia cuestionable [Lepage et al. 2004]. Parece ser que esta micosis es más común de lo que se piensa, aunque raramente se identifica la especie fúngica participante. De las especies implicadas destaca, de forma extraordinaria, Aspergillus nidulans por su alta frecuencia de aislamiento, en comparación con el bajo porcentaje que presenta en general esta especie en otras micosis. Sus cultivos se caracterizan por presentar ascosporas rojizas, lenticulares, de paredes lisas con dos crestas ecuatoriales, formadas en cleistotecios marrón rojizos rodeados de numerosas células de Hülle, lo que la diferencian fácilmente de la mayoría de especies de este género [Cabañes et al. 2002]. Las colonias suelen presentar diversas coloraciones según los medios de cultivo utilizados, creciendo perfectamente a 45ºC.

Anverso de las colonias de una cepa de Aspergillus nidulans aislada de un caso de micosis de las bolsas guturales. El cultivo se realizó en el medio agar Czapek extracto de levadura. a 37°C. Se puede observar las gotas de exudado sobre las colonias y el pigmento difusible, ambos de color rojizo, característicos de esta especie al desarrollarse en este medio. F. Javier Cabañes©

También es extraordinario el porcentaje de aspergilosis invasora causada por A. nidulans en pacientes humanos con enfermedad granulomatosa crónica, una inmunodeficiencia primaria rara que afecta principalmente a la función de los fagocitos, que puede llegar a ser del 33%. De forma general, las aspergilosis invasoras tienen lugar en pacientes con neoplasias hematológicas e inmunodeficiencias importantes y están causadas comúnmente por Aspergillus fumigatus, siendo A. nidulans responsable de tan sólo el 1% de los casos. Investigaciones recientes [Gresnigt et al. 2018] demuestran que los conidios de esta especie son fagocitados y procesados por los macrófagos a un ritmo más lento en comparación con los de A. fumigatus, por lo que se reduce la tasa de mortalidad fúngica y aumenta la germinación de los conidios. Esta tasa más lenta de eliminación de A. nidulans podría permitir un crecimiento excesivo de esta especie en ciertos ambientes inmunes.

Desconocemos si esta diferencia de respuesta inmune innata se produce en las bolsas guturales. No obstante, la diferente actividad fagocitaria demostrada frente a estas dos especies fúngicas podría facilitar la colonización de A. nidulans en este entorno y por lo tanto también podría ser la responsable del elevado porcentaje de casos producidos de micosis de las bolsas guturales por esta especie.

Aspergilosis, avicultura y resistencia a antifúngicos. F. Javier Cabañes

Septiembre 2019.

La aspergilosis aviar es principalmente una enfermedad respiratoria que afecta a todo tipo de aves y que está causada mayoritariamente por Aspergillus fumigatus. Factores como la presencia abundante de conidios en el ambiente, la afectación del sistema inmunitario por stress, entre otras causas, y el especial tracto respiratorio que presentan estos animales, los hacen más susceptibles a la infección por esta especie.

En avicultura, los sistemas intensivos de producción pueden llegar a favorecer algunas de estas situaciones si las condiciones de manejo e higiene no son las adecuadas. Son críticas las cámaras de incubación de huevos, las salas de nacimiento y la calidad de las yacijas utilizadas para los pollitos. En estas instalaciones se pueden llegar a concentrar a una elevada cantidad de conidios que presentan diámetros de unos 2-3 micrómetros en el caso de A. fumigatus, siendo de los más pequeños que nos podemos encontrar en las especies de Aspergillus.

Características cabezas conidiales de Aspergillus fumigatus. Los conidios presentan diámetros de alrededor de 2-3 micrómetros. F. Javier Cabañes©

Una de las principales vías de entrada de los conidios en las incubadoras son los huevos contaminados. Las esporas presentes en la cáscara pueden penetrar al interior del huevo por finas grietas presentes en la misma, y encontrar las condiciones óptimas de cultivo para generar millones de nuevos conidios en pocas horas. Los conidios de A. fumigatus se mantienen y pueden incrementarse rápidamente en una amplia gama de condiciones, pero sobre todo en materia orgánica como la yema de huevo, cajas de cartón, serrín, viruta, paja troceada y residuos de pienso, que se pueden encontrar en distintas salas utilizadas en la producción avícola. Además las condiciones de alta humedad y temperatura (37-45°C) que se dan en estas instalaciones favorecen el crecimiento de esta especie termófila.

Los pollitos aspiran estas esporas y debido a su pequeño tamaño llegan fácilmente a pulmones y sacos aéreos causando la forma aguda de la enfermedad. Esta forma es la responsable del aumento de mortalidad observada en los primeros días de vida de los pollitos. En las aves infectadas, los sacos aéreos y los pulmones suelen presentar nódulos blancos o amarillentos e incluso placas micóticas verdosas características de esta especie. Las formas subagudas y crónicas se detectan en aves de mayor edad y la infección puede llegar a diseminarse a otros órganos.

Neumonía granulomatosa en un caso de aspergilosis aviar. Se observan abundantes nódulos en los pulmones de un pollo de engorde. Fotografía cortesía de Natàlia Majó (Servicio de Diagnóstico de Patología Veterinaria. UAB) ©

En contraste con lo que ocurre con los aislamientos realizados en otros animales o en el hombre, en aves de corral e instalaciones dedicadas a su producción, de la sección Fumigati, sólo se aíslan cepas de A. fumigatus sensu stricto. Aunque no existen muchos estudios sobre este tema, no se han detectado especies crípticas próximas a esta especie (ver blog julio 2019). En un estudio realizado con 175 cepas procedentes mayoritariamente de aves de corral de Francia y China, todas fueron identificadas como A. fumigatus [Wang et al. 2014]. Ninguna de las cepas estudiadas fue considerada resistente al itraconazol. Si bien el tratamiento con antifúngicos no se practica en estos sistemas de producción, si se pueden utilizar determinados azoles para la desinfección de las instalaciones, y/o la prevención de algunas micosis. Por lo tanto, tiene importancia conocer el riesgo potencial de aparición de cepas resistentes relacionadas con la producción avícola, ya que la resistencia a antifúngicos en cepas de A. fumigatus de origen clínico y ambientales es un problema emergente.

Diversos antifúngicos triazólicos (p.e. itraconazol, voriconazol) se recomiendan como fármacos de elección en el tratamiento y la profilaxis de la aspergilosis en humanos, siendo el factor principal de la selección de cepas resistentes en A. fumigatus. No obstante, también se han detectado numerosas cepas resistentes de esta especie que se relacionan con el uso masivo de numerosos fungicidas triazólicos en agricultura para prevenir y controlar diversas enfermedades en cereales, frutas, legumbres y plantas ornamentales [Chowdhary et al. 2013]. No sabemos si esto mismo acabará ocurriendo en las explotaciones avícolas donde A. fumigatus sigue prevaleciendo.